連関資料 :: 実験
資料:323件
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DNA実験
- １．表題 分子生物学 基礎実験 そのⅠ ２．目的 細菌やカビがもつ、染色体とは独立に自己複製を行う核外遺伝子であるプラスミド。このプラスミドについて今回の実験では、プラスミドベクターと外来遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いて形質転換の実験とプラスミド調製の実験を通して形質転換とプラスミド調製の原理を知る。制限酵素で調製したDNAを切断し、アガロースゲル電気泳動で目的DNA断片（外来遺伝子）を確認する実験を通して制限酵素の意義を理解し、アガロースゲル電気泳動の原理を知る。 ３．材料と方法 Ⅰ．形質転換 材料：LB培地、アンピシリン（Amp）、0.1M塩化カルシウム、SOC培地、 X-gal（β―ガラクトシダーゼにより分解され青色に発色）、 IPTG（lacリプレッサーに結合し、LacZプロモーターからのLacZの転写を誘導するオペロンにおける誘導体として機能する。代謝によって分解されないので、ラクトースの代わりに使用する） pUC19（α断片をコードする遺伝子の途中にMCSがあり、このMCSの向きがpUC18とは逆になっている。Amp耐性遺伝子を持つ） pUC(3HBDH)19（pUC19に3HBDHという挿入遺伝子[インサートDNA]が存在する） JM109（α相補性が可能な宿主大腸菌。対数増殖期の初期ではOD₆₀₀=0.540である） 装置：高速遠心機、50ml遠心チューブ、1.5mlエッペンチューブ、インキュベータ 恒温水槽、卓上クリーンブース、ガスバーナー、マイクロピペット、チップ、 ボルテックスミキサー A）塩化カルシウム法（無菌実験であった） ①37℃で16－20時間培養（前培養）しておいたプレートより単一コロニー （直径2－3mm）をとる。 ②50ml遠心チューブに入った15mlLB培地に300μℓ前培養した大腸菌を植え継ぎ、これを37℃で2時間位、OD₆₀₀が0.4～0.8になるまで振とう培養する。 ③培養液を50ml遠心チューブに移し、0℃になるまで氷上で10分間冷却する。 →ここまでは用意されていた。 ④4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑤卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。この際クリーンブース 内に持ち込む器具は70％エタノールで拭いた。50ml遠心チューブの蓋は火で炙った（滅菌処理）。 ⑥DNAの細胞膜表面への吸着を引き起こすため冷0.1M塩化カルシウムを1.5ml （750μℓ×2 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。氷上で15分間放置した。 ⑦4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑧卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。1分間乾燥した。 ⑨冷0.1M塩化カルシウムを0.6ml （600μℓ×1 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。 →コンピテントセル作製 ⑩ピペットチップを使い、塩化カルシウムでのコンピテントセルをエッペンチューブに50μℓずつ分注した。（ピペットチップ、エッペンチューブは滅菌してあるものを使った）ここに、プラスミドDNA溶液を静かに加えた。（下表参照）氷中でチューブをかき回す程度に混合した。そのまま氷上で30分間放置した。 コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl プラスミドDNAは何も入れない ｐUC19 50μl／ｍｌを5μl ｐUC（3HBDH）19 50μl／ｍｌを5μl 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる ⑪ヒートショックで細胞内にDNAを入れるため4
- レポート 理工学 DNA 形質転換 電気泳動
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全体公開 2014/07/27
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タンパク質に関する実験
- 生物化学実験レポート タンパク質に関する実験 １．寒天ゲル電気泳動 pH8.6、4.3での泳動と染色・脱染色 11月20日：pH8.6での泳動と染色・脱染色 【目的】タンパク質の電気泳動では、両性電解質溶液を電気泳動すると陽極側が酸性、陰極側がアルカリ性になり、ここにタンパク質を加えると各タンパク質が等電点の順に並ぶ。荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中に pH 勾配があると、荷電が0となる点（ 等電点 ）で停止する。これが等電点電気泳動である。(電気泳動法は、DNAやRNAなど核酸を分離するのにも広く用いられており、分子生物学の基本技術のひとつといえる。)この 等電点 の違いにより物質を分離する等電点電気泳動(IEF)を、セルロースアセテート膜を担体として用いてTris Gly HCl 緩衝液pH8.6で試料タンパク質を分離する。アミドブラック－10Bの7％酢酸溶液でタンパク質を固定・染色し、7％酢酸で背景を脱染色してタンパク質の易動度を観察する。 【試薬と器具】〔試料〕Albumin(bovine serum)[分子量66.000、等電点4.7~4.9]、Hemoglobin(human blood)[分子量64.550、等電点6.8~7.0]、Lysozyme(egg white)[分子量14.300、等電点11.0~11.4] 以上のたんぱく質を0.6％NaCL溶液(0.02％NaN3を含む)に4mg/ml(0.4％)になるように溶解した溶液を使用する。 〔担体〕セルロースアセテート膜：1枚 〔pH8.6緩衝液〕Tris:30.29g Gly:7.51g HCl:1N42g DW:1L buffer〔マーカー〕Bromphenol blue（BPB）0.1％水溶液、Metyl green(MG) 0.1％水溶液 〔染色液〕Amido Schwartz 10B 0.2％脱染色液溶液 〔脱染色液〕7％酢酸水溶液 DW、泳動槽、ろ紙、ピンセット、ガラス板 【方法】１）セルロースアセテート膜を槽にセットし(ろ紙で足りない部分はブリッジ)、短冊状に切ったろ紙を緩衝液に浸した後、ガラス板上のセルロースアセテート膜と電極槽を接続した。 ２）約1×10mlのNO.2ろ紙を試料に浸し、キムワイプで過剰の試料を取り除き、セルロースアセテート膜の極側に長辺が平行になるよう密着させて置いた。また試料を置いた場所をマークするため、墨汁とろ紙片と並べてスポットした。 ３）マーカーのBPB溶液とMG溶液は、2×2mmのNO.2ろ紙を用いて試料と同位置に試料と重ならないようにセルロースアセテート膜上にスポットした。 ４）150V・30分間、泳動槽で泳動させた。 ５）泳動終了後、セルロースアセテート膜を染色槽に入れ、約2分間染色した。 ６)メンブレンを傷つけないように染色液から脱染色液(7％酢酸水溶液)に移し、槽を穏やかにゆすった。また液は３回交換した。 ７)アセテートセルロース膜を、ガラス板に載せ乾燥させた。 【結果】 pH8.6 150V・30分間 泳動槽で泳動させたら、Hemoglobinは＋側に1.2㎝、Lysozymは －側に3.3㎝、BSAは＋側に2.2㎝動いた。 表１ タンパク質 等電点 等電点－緩衝液のpH 移動方向 移動距離(cm) Hemoglobin 6.8～7.0 －1.6～－1.8 ＋ 1.2 Lysozym 11.0～11.4 2.4～2.8 － 3.3 BS
- レポート 理工学 タンパク質 等電点 pH
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真空実験
- 真空実験 実験日 5月17,18,19日 実験場所 物理学生実験室1(1301),2(1303) 実験環境 17日 気温：25.4℃ 湿度：82％ 気圧：752.8hPa 18日 気温：24.8℃ 湿度：76％ 気圧：752.4hPa 19日 気温：25.5℃ 湿度：86％ 気圧：752.4hPa 目的 真空計を組み立て、放電管を用いて真空度による放電状況の変化を知る。次に、油拡散ポンプで排気し、到達真空度を測定する。排気速度を計る。 原理 廃棄ポンプは単位時間に排気する体積S[l/sec]で表される。圧力p[Torr]、体積V[l]の真空容器を排気することを考える。 気体の状態方程式からpV=nRTであり一定体積、温度の下では圧力と分子数は比例している。単位時間に排気される分子数は比例している。単位時間に排気される分子数 は (1) である。これを圧力で書き直すと より (2) これを解くと (3) となる。この式は充分に長い時間排気すれば、完全な真空になることを意味している。実際には、真空容器の漏れなどの制限要因によって、ある真空度までしか排気することはできない。漏れは大気との間で生じると考えてよく、大気圧に比較すれば真空容器内の圧力はゼロとみなしてよいから、真空容器の圧力pには依存せず一定値であるとしてよい。 単位時間内に容器内にもれこむ分子数をqとすると (1’) 圧力に書き直して (2’) ここで、 の単位は[Torr・l/sec]で、単位時間の漏れを表す。到達圧力はこの式から (4) であることがわかる。 実験装置 注射器ポンプ、ダイアフロムポンプ、アスピレーター、誘導コイル 油回転ポンプ － 油回転ポンプの主要部分は固定子と回転子及びスプリングで固定子の内壁に接触しながら回転する翼板からできている。ローターが回転することで、膨張による吸気と圧縮による排気を同時に行うことができる。 油拡散ポンプ － 油拡散ポンプは油の蒸気で噴流を作り、拡散で噴流に飛び込んだ気体分子を捕らえて運び去り、高真空を得るポンプである。油拡散ポンプは単体で真空を作ることはできず、補助真空側に油回転ポンプをつなぎ、ある程度の真空状態にしておく。 ブルドン管 － ブルドン管は数Torrまでの真空をモニターする真空系である。構造は単純で、息を吹き込むと巻いていた紙の筒が伸びる玩具と同じで、薄い金属板を張り合わせて筒を作っている。管内の気圧が低くなると大気に押されて巻きが戻るように作られていて、その先端に目盛の指示器がついている。 ガイスラー管 － ガイスラー管はガラス管に1対のアルミニウム電極を10cmくらいの間隔で取り付けたものである。両端を誘導コイルにつなぎ、その一次線に100Vの交流を入れると二次側には高圧 (10~50kV) が得られる。放電管の真空度が進むにつれて放電状況がさまざまに変化する。この放電パターンによって圧力のおおよその見当と発光の色でガスの種類についての情報を得ることができる。 ピラニー真空計 － ピラニーゲージは気体の熱伝導を利用した真空系である。タングステンや白金の細線に電流を流し200度から400度に加熱しておく。周辺の真空度が上がり、熱を奪う分子が減少すると温度の低下が少なくなり抵抗が下がる。これを精密なホイートストーンブリッジ回路で検出し真空度と対応づける。 電離真空計 － 電離真空計は、気体分子を電離させ、生成したイオンの数から圧力を求める真空計で、高真空から超高真空領域で広く用いられており、定量性に優れている。 実験方法 A-
- レポート 理工学 真空 油拡散ポンプ 放電
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