タンパク質に関する実験

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    生物化学実験レポート
    タンパク質に関する実験
    1.寒天ゲル電気泳動
    pH8.6、4.3での泳動と染色・脱染色
    11月20日:pH8.6での泳動と染色・脱染色
    【目的】タンパク質の電気泳動では、両性電解質溶液を電気泳動すると陽極側が酸性、陰極側がアルカリ性になり、ここにタンパク質を加えると各タンパク質が等電点の順に並ぶ。荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中に pH 勾配があると、荷電が0となる点( 等電点 )で停止する。これが等電点電気泳動である。(電気泳動法は、DNAやRNAなど核酸を分離するのにも広く用いられており、分子生物学の基本技術のひとつといえる。)この 等電点 の違いにより物質を分離する等電点電気泳動(IEF)を、セルロースアセテート膜を担体として用いてTris Gly HCl 緩衝液pH8.6で試料タンパク質を分離する。アミドブラック-10Bの7%酢酸溶液でタンパク質を固定・染色し、7%酢酸で背景を脱染色してタンパク質の易動度を観察する。
    【試薬と器具】〔試料〕Albumin(bovine serum)[分子量66.000、等電点4.7~4.9]、Hemoglobin(human blood)[分子量64.550、等電点6.8~7.0]、Lysozyme(egg white)[分子量14.300、等電点11.0~11.4]
    以上のたんぱく質を0.6%NaCL溶液(0.02%NaN3を含む)に4mg/ml(0.4%)になるように溶解した溶液を使用する。
    〔担体〕セルロースアセテート膜:1枚
    〔pH8.6緩衝液〕Tris:30.29g Gly:7.51g HCl:1N42g DW:1L buffer〔マーカー〕Bromphenol blue(BPB)0.1%水溶液、Metyl green(MG)  0.1%水溶液
    〔染色液〕Amido Schwartz 10B 0.2%脱染色液溶液
    〔脱染色液〕7%酢酸水溶液
    DW、泳動槽、ろ紙、ピンセット、ガラス板
    【方法】1)セルロースアセテート膜を槽にセットし(ろ紙で足りない部分はブリッジ)、短冊状に切ったろ紙を緩衝液に浸した後、ガラス板上のセルロースアセテート膜と電極槽を接続した。
            2)約1×10mlのNO.2ろ紙を試料に浸し、キムワイプで過剰の試料を取り除き、セルロースアセテート膜の極側に長辺が平行になるよう密着させて置いた。また試料を置いた場所をマークするため、墨汁とろ紙片と並べてスポットした。
    3)マーカーのBPB溶液とMG溶液は、2×2mmのNO.2ろ紙を用いて試料と同位置に試料と重ならないようにセルロースアセテート膜上にスポットした。
         4)150V・30分間、泳動槽で泳動させた。
         5)泳動終了後、セルロースアセテート膜を染色槽に入れ、約2分間染色した。
         6)メンブレンを傷つけないように染色液から脱染色液(7%酢酸水溶液)に移し、槽を穏やかにゆすった。また液は3回交換した。
         7)アセテートセルロース膜を、ガラス板に載せ乾燥させた。
    【結果】
    pH8.6
    150V・30分間  泳動槽で泳動させたら、Hemoglobinは+側に1.2㎝、Lysozymは
    -側に3.3㎝、BSAは+側に2.2㎝動いた。
    表1
    タンパク質 等電点 等電点-緩衝液のpH 移動方向 移動距離(cm) Hemoglobin 6.8~7.0 -1.6~-1.8 + 1.2 Lysozym 11.0~11.4 2.4~2.8 - 3.3 BS

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    生物化学実験レポート
    タンパク質に関する実験
    1.寒天ゲル電気泳動
    pH8.6、4.3での泳動と染色・脱染色
    11月20日:pH8.6での泳動と染色・脱染色
    【目的】タンパク質の電気泳動では、両性電解質溶液を電気泳動すると陽極側が酸性、陰極側がアルカリ性になり、ここにタンパク質を加えると各タンパク質が等電点の順に並ぶ。荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中に pH 勾配があると、荷電が0となる点( 等電点 )で停止する。これが等電点電気泳動である。(電気泳動法は、DNAやRNAなど核酸を分離するのにも広く用いられており、分子生物学の基本技術のひとつといえる。)この 等電点 の違いにより物質を分離する等電点電気泳動(IEF)を、セルロースアセテート膜を担体として用いてTris Gly HCl 緩衝液pH8.6で試料タンパク質を分離する。アミドブラック-10Bの7%酢酸溶液でタンパク質を固定・染色し、7%酢酸で背景を脱染色してタンパク質の易動度を観察する。
    【試薬と器具】〔試料〕Albumin(bovine serum)[分子量66.000、等電点4.7~4.9]、..

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