RT-PCRによる遺伝子発現解析実験

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    RT-PCRによる遺伝子発現解析実験
    実験日 7月12日
    目的 暗所に順応させたタバコと、短時間の光照射を行ったタバコを用い、光によって転写レベルで発現誘導を受ける葉緑体遺伝子(psbD)のmRNAの変動を測定する
    原理
    RT-PCR : 遺伝子発現を調べる実験で、目的遺伝子の発現量が少ないとき、調整できるRNA量に限界があるときは、PT-PCRが威力を発揮する。RT-PCRはRNAを逆転者反応によりcDNAにし、これに対してPCRを行うものである。
    psbD遺伝子 : 光合成の光化学系IIの反応中心タンパク質D2をコードする葉緑体遺伝子。青色光・近紫外光で特異的な発現誘導を受ける。psbD上流の光応答プロモーター(psbD LRP)が光による活性化を受ける。
    実験材料
    実験1
    3日間暗処理を行ったタバコ(D),暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L)
    TRIzol(酸性フェノール,タンパク質変性剤) 500μl
    クロロフォルム 100μl
    イソプロパノール 250μl
    75%エタノール 500μl
    DW
    実験2
    RT反応液 9μl
    MgCL2 5ml
    10XRT buffer x1
    dNTP 1mM
    Rnase Inhibitor 1U/μl
    AMV 逆転写酵素 0.25 U/μl
    Random 9 primer 2.5μM
    RNA sample 0.2μg
    RNA(0.2μg/μl) 1μl
    PCR反応液 40μl
    5X PCR buffer x1
    Ex Taq 1.25U/μl
    PsbD 上流primer 0.2μM
    PsbD下流 primer 0.2μM
    実験3
    6x loading buffer 2μl
    1%アガロースゲル
    実験4
    ・RNA loading buffer 6μl
    実験方法
    実験1 RNAの抽出
    3日間暗処理を行ったタバコ(D)、および暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L)をもちいた。
    約100mgのタバコ葉をエッペンチューブに入れた。
    直ちに500μlのTRIzolを加え、ペッセルで完全にすりつぶした。
    室温で5分間静置した。
    100μlのクロロフォルムを加え、15秒間手で振ってよく攪拌した。室温に2-3分間静置した。
    12000xg、4℃で10分間遠心分離した。
    300μlの上澄み液を別のクリーンなエッペンチューブに移した。
    250μlのイソプロパノールを加え、混合した。
    10分間室温で静置した。
    12000xg、4℃で10分間遠心分離した。
    上澄み液をピペットマンで完全に吸い取った。この時、沈殿を吸わないように注意した。
    RNAの沈殿に500μlの75%エタノールを加え、エッペンチューブを軽く傾けて内壁を洗った。激しく攪拌してはいけない。
    12000xg、4℃で5分間遠心分離し、上澄みを吸い取った。
    5分間風乾した。
    50μlのDWに溶解した。使用するまで、氷上に静置した。
    サンプルを2μl取り、98μlの水で100倍希釈し、紫外線吸収を測定した(230,260,280nm)。
    実験2 RT-PCR反応
    各自のRNAサンプルを0.2μg /μlに希釈した。
    PCRチューブにRT反応液9μlを入れた。
    0.2μg /μlのRNAを1μl加えた。
    反応液をピペットマンを使い静かに混合した。
    スピンダウンをした。
    PCR装置にセットした。
    次の条件で逆転写反応を行った。
    30℃ 10min
    55℃ 25min
    99℃ 5min
    5℃ 5min
    逆転写反応が終わったら、PCRチューブを氷上に置き、スピンダウン

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    RT-PCRによる遺伝子発現解析実験
    実験日 7月12日
    目的 暗所に順応させたタバコと、短時間の光照射を行ったタバコを用い、光によって転写レベルで発現誘導を受ける葉緑体遺伝子(psbD)のmRNAの変動を測定する
    原理
    RT-PCR : 遺伝子発現を調べる実験で、目的遺伝子の発現量が少ないとき、調整できるRNA量に限界があるときは、PT-PCRが威力を発揮する。RT-PCRはRNAを逆転者反応によりcDNAにし、これに対してPCRを行うものである。
    psbD遺伝子 : 光合成の光化学系IIの反応中心タンパク質D2をコードする葉緑体遺伝子。青色光・近紫外光で特異的な発現誘導を受ける。psbD上流の光応答プロモーター(psbD LRP)が光による活性化を受ける。
    実験材料
    実験1
    3日間暗処理を行ったタバコ(D),暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L)
    TRIzol(酸性フェノール,タンパク質変性剤) 500μl
    クロロフォルム 100μl
    イソプロパノール 250μl
    75%エタノール 500μl
    DW
    実験2
    RT反応液 9μl
    MgCL2 5ml
    10XRT buffer..

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