RT-PCRによる遺伝子発現解析実験 実験日 7月12日 目的 暗所に順応させたタバコと、短時間の光照射を行ったタバコを用い、光によって転写レベルで発現誘導を受ける葉緑体遺伝子(psbD)のmRNAの変動を測定する 原理 RT-PCR : 遺伝子発現を調べる実験で、目的遺伝子の発現量が少ないとき、調整できるRNA量に限界があるときは、PT-PCRが威力を発揮する。RT-PCRはRNAを逆転者反応によりcDNAにし、これに対してPCRを行うものである。 psbD遺伝子 : 光合成の光化学系IIの反応中心タンパク質D2をコードする葉緑体遺伝子。青色光・近紫外光で特異的な発現誘導を受ける。psbD上流の光応答プロモーター(psbD LRP)が光による活性化を受ける。 実験材料 実験1 3日間暗処理を行ったタバコ(D),暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L) TRIzol(酸性フェノール,タンパク質変性剤) 500μl クロロフォルム 100μl イソプロパノール 250μl 75%エタノール 500μl DW 実験2 RT反応液 9μl MgCL2 5ml 10XRT buffer x1 dNTP 1mM Rnase Inhibitor 1U/μl AMV 逆転写酵素 0.25 U/μl Random 9 primer 2.5μM RNA sample 0.2μg RNA(0.2μg/μl) 1μl PCR反応液 40μl 5X PCR buffer x1 Ex Taq 1.25U/μl PsbD 上流primer 0.2μM PsbD下流 primer 0.2μM 実験3 6x loading buffer 2μl 1％アガロースゲル 実験4 ・RNA loading buffer 6μl 実験方法 実験1 RNAの抽出 3日間暗処理を行ったタバコ(D)、および暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L)をもちいた。 約100mgのタバコ葉をエッペンチューブに入れた。 直ちに500μlのTRIzolを加え、ペッセルで完全にすりつぶした。 室温で5分間静置した。 100μlのクロロフォルムを加え、15秒間手で振ってよく攪拌した。室温に2－3分間静置した。 12000xg、4℃で10分間遠心分離した。 300μlの上澄み液を別のクリーンなエッペンチューブに移した。 250μlのイソプロパノールを加え、混合した。 10分間室温で静置した。 12000xg、4℃で10分間遠心分離した。 上澄み液をピペットマンで完全に吸い取った。この時、沈殿を吸わないように注意した。 RNAの沈殿に500μlの75％エタノールを加え、エッペンチューブを軽く傾けて内壁を洗った。激しく攪拌してはいけない。 12000xg、4℃で5分間遠心分離し、上澄みを吸い取った。 5分間風乾した。 50μlのDWに溶解した。使用するまで、氷上に静置した。 サンプルを2μl取り、98μlの水で100倍希釈し、紫外線吸収を測定した(230,260,280nm)。 実験2 RT-PCR反応 各自のRNAサンプルを0.2μg /μlに希釈した。 PCRチューブにRT反応液9μlを入れた。 0.2μg /μlのRNAを1μl加えた。 反応液をピペットマンを使い静かに混合した。 スピンダウンをした。 PCR装置にセットした。 次の条件で逆転写反応を行った。 30℃ 10min 55℃ 25min 99℃ 5min 5℃ 5min 逆転写反応が終わったら、PCRチューブを氷上に置き、スピンダウン