https://www.happycampus.co.jp/public/tags/%E5%88%B6%E9%99%90%E9%85%B5%E7%B4%A0/ タグ“制限酵素”の公開資料 ja-JP happycampus rss generator https://www.happycampus.co.jp cs@happycampus.co.jp cs@happycampus.co.jp Copyrightⓒ 2002-2026 AgentSoft Co., Ltd. All rights reserved Wed, 08 Feb 2012 19:29:40 +0900

生物系基礎実習レポート Ⅰ-3　核酸の分析 実験実施日 2010/07/09 Fri, 2010/07/14 Wed, 2010/07/15 Thu 提出日 2010/08/20 Fri Ⅰ-3.1　電気泳動法による核酸の解析 Ⅰ．目的 　　核酸研究の基本操作を習得する．臓器からのDNAの抽出を行い，吸光度による定量的解析，電気泳動による定性的解析を行う．また，得られた染色体DNAの制限酵素処理による影響を観察する． Ⅱ．操作 重要な操作については（）内に青字でその意義を示した． 約50mgの肝組織をエッペンに取り，500μLのExtraction Bufferを加えた．（界面活性剤で生体膜成分である脂質を分解した）さらに40μLの20mg/mL Proteinase K を加えた．（細胞由来のRNA分解酵素など，サンプル中のタンパク質を分解した）十分にボルテックス（機械による振動で混液）した．Proteinase K の至適温度である55℃で20分間湯浴した．この際5分おきにボルテックスで混液した．次に，200μLの5M NaClを加えて2秒ボルテックスし，55℃で5分間水浴で反応させた．（タンパク質を塩析させる）5分間氷冷しSDSを含む沈殿を析出させた．12500rpm,4℃,1分間遠心分離した．別のチューブに上清をとり700μLのイソプロパノールを加え，室温で5分間転倒混和してよく混ぜた．（アルコール沈殿により核酸と糖を溶液から濃縮・分離させた）白くもやもやとしたものが徐々に発生し，沈殿となった．5000rpm,4℃,1分間遠心分離し，上清を完全に取り除いた後，420μLのTE（EDTA含有緩衝液）を加え沈殿を溶解させたのち，スピンダウンした．（卓上遠心分離機にかけた）20μLのサンプルをRNaseA未処理サンプルとして0.5μLのチューブに取り，残り400μLのサンプルに5μLの10mg/mL RNaseAを加えて2秒間ボルテックスし，55℃で15分間湯浴した．（サンプル中のRNAを分解した）次に5μLの20mg/mL Proteinase Kを加えて秒間ボルテックスし，55℃で15分間湯浴した．（RNaseAを分解した）これに40μLの酢酸ナトリウムを加えて2秒間ボルテックスし（サンプル中のDNAの負電荷を相殺し，アルコール沈殿の効率を上げた），440..]]> Wed, 12 May 2010 00:20:48 +0900

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遺伝子工学基礎実験 ＜実験操作＞ DNA断片の分離（3日目） プラスミドDNAの制限酵素による切断 　以下の溶液を順に混合した。 プラスミドDNA溶液 制限酵素用緩衝液(H Buffer) 制限酵素(EcoRⅠ) 制限酵素(XhoⅠ) 　　　　混合後37℃で30分間反応させる。 　　 アガロースゲル電気泳動 ２）のアガロースゲルの作成と同様にして電気泳動用アガロースゲルを作る。次に制限酵素反応溶液を2ウェルに分けて入れ、マーカーDNA溶液とともに流した。 　 DNA断片の分離・精製 　　 電気泳動終了後、ゲルをトランスイルミネーター上で、カッターを使ってインサート、ベクターを別々に切り出した。それぞれ重さを量ったエッペンチューブにとり、再びエッペンチューブごと重さを量り、入れたゲルの重さを算出した。ゲル1mgにつき1μlのcapture bufferを加えボルテックスでよく混合し、ゲルが完全に溶けるまで60℃で保温した。 　　 完全に溶けたサンプルをFlashした後、GFXカラムをチューブにセットし、サンプル溶液全量をカラムに入れ、そのまま室温で1分間置いた。カラムを13000rpmで..]]> Sat, 21 Jun 2008 18:57:11 +0900

分子生物学実験 ＜目的＞ 遺伝子の増幅と解析の原理と方法を理解するとともに、具体的な手法を身につける。 ＜原理＞ カラーセレクションの原理 クローニングベクターであるpBluescriptは制限酵素EcoRIによってMCS部が切断[302]
]]> Fri, 19 Jan 2007 10:33:55 +0900

DNA実験 １、目的　制限酵素処理したDNAと未処理のDNAを用いて電気泳動を行い、その移動差を測定する。この移動差がプラスミドDNAのどのような違いに基づくものかを推定する。また、実験結果から制限酵素によりベクターがどのような作用を受けた[334]
DNA実験 １、目的　制限酵素処理したDNAと未処理のDNAを用いて電気泳動を行い、その移動差を測定する。この移動差がプラスミドDNAのどのような違いに基づくものかを推定する。また、実験結果から制限酵素によりベクターがどのような作用を受けたかを調べる。 ２、材料と方法 　Ⅰ制限酵素処理 　　　まずマイクロピペットを用いて、プラスミドDNAを4μℓ、10x制限酵素用バッファーを2μℓ、H2Oを13μℓ、制限酵素１μℓをマイクロチューブに入れる。プラスミドDNAはa,bの２種類。制限酵素はEcoRⅠ、PstⅠの２種類を用意した。それぞれの組み合わせにより４種類のサンプルを作った。 １…a/Ec 2…a/Ps 3…b/Ec 4…b/Ps それぞれのサンプルは軽く撹拌して数秒程度遠心して37℃の恒温槽で1時間反応させた。反応させている間にアガロースゲルの作製を行った。 　Ⅱアガロースゲル電気泳動 　　ア、アガロースゲルの作製 　　　　0.6ｇのアガロースの入った三角フラスコに泳動バッファー50ml加えて電子レンジで温めた。約60℃になったところでゲル作成台に流し込み約30分間放置した。ゲルが..]]> Wed, 28 Jun 2006 14:17:05 +0900

ウシ血清からのIgG抗体の精製の目的・手順 目的 Protein　G　sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、ウシ血清に含まれるIgG抗体を精製する。 手順 ?Protein G sepharose4 Fast[246]
ウシ血清からのIgG抗体の精製の目的・手順 目的 Protein　G　sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、ウシ血清に含まれるIgG抗体を精製する。 手順 ①Protein G sepharose4 Fast FrowをPoly prepカラムに500μl加える。さらにTBSを10ｍｌ加え、室温で５分間静置【カラムの平衡化】 ②ウシ血清1mlとTBS1mlを2mlチューブで混ぜる ③ウシ血清サンプルをカラムに加え、シーソーシェーカーで１５分間振とうしながら反応させる ④壁を洗うようにカラムにTBSを10ml加え素通し、下部のふたをして、再びカラムにTBS10ml加える。 ⑤上部、下部のふたを外してバッファーをビーカーに捨てる。上部、下部のふたを蒸留水でよく洗浄 ⑥下部のふたをして、再びカラムにTBS10mlを加えて、④⑤を再び行う。この洗浄を全部で３回繰り返す。 ⑦カラムにTBS30mlを素通しする。キムワイプを下部につけ、毛細現象を利用しながら余分なバッファーを吸い取る。 ⑧【溶出】0.1M Glycine Buffer(pH2.2)50μlを加え、指で軽く混..]]> Sun, 12 Mar 2006 18:48:56 +0900

?）DNA-1　大腸菌プラスミドDNAの精製 目的 　今回の実習は、核酸の基本的な取り扱い法と性質を理解することを目的とする。DNA-1では大腸菌プラスミドDNA（pUC19）を簡便法で精製することを試みる。 手順 １． プラスミド[298]
核酸に関する実習 実験日　12月14、15日（水、木） Ⅰ）DNA-1　大腸菌プラスミドDNAの精製 目的 　今回の実習は、核酸の基本的な取り扱い法と性質を理解することを目的とする。DNA-1では大腸菌プラスミドDNA（pUC19）を簡便法で精製することを試みる。 手順 １． プラスミドpUC18を有する大腸菌DH5α株のovernight culture 1.5mLを1.7mL tube２本にとり、12,000rpmで２分間遠心した。 ２．Ｐ-200のピペットマンで上清を完全に除いた後、菌体に200μLのCell Resuspention Solution①を加え、菌体をピペットマンで均一に懸濁した。 ３．250μLのCell Lysis Solution②を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして菌体を溶かした。 ４．250μLのNeutralization Solution③を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして液を中和した。 ５．４の混合液を12,000rpmで５分間遠心し、上清を別の1.7mL tubeに取った。 ６．均一に撹拌した200μLのQuantum Matrix④を..]]>