連関資料 :: 実験
資料:323件
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DNA実験
- １．表題 分子生物学 基礎実験 そのⅠ ２．目的 細菌やカビがもつ、染色体とは独立に自己複製を行う核外遺伝子であるプラスミド。このプラスミドについて今回の実験では、プラスミドベクターと外来遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いて形質転換の実験とプラスミド調製の実験を通して形質転換とプラスミド調製の原理を知る。制限酵素で調製したDNAを切断し、アガロースゲル電気泳動で目的DNA断片（外来遺伝子）を確認する実験を通して制限酵素の意義を理解し、アガロースゲル電気泳動の原理を知る。 ３．材料と方法 Ⅰ．形質転換 材料：LB培地、アンピシリン（Amp）、0.1M塩化カルシウム、SOC培地、 X-gal（β―ガラクトシダーゼにより分解され青色に発色）、 IPTG（lacリプレッサーに結合し、LacZプロモーターからのLacZの転写を誘導するオペロンにおける誘導体として機能する。代謝によって分解されないので、ラクトースの代わりに使用する） pUC19（α断片をコードする遺伝子の途中にMCSがあり、このMCSの向きがpUC18とは逆になっている。Amp耐性遺伝子を持つ） pUC(3HBDH)19（pUC19に3HBDHという挿入遺伝子[インサートDNA]が存在する） JM109（α相補性が可能な宿主大腸菌。対数増殖期の初期ではOD₆₀₀=0.540である） 装置：高速遠心機、50ml遠心チューブ、1.5mlエッペンチューブ、インキュベータ 恒温水槽、卓上クリーンブース、ガスバーナー、マイクロピペット、チップ、 ボルテックスミキサー A）塩化カルシウム法（無菌実験であった） ①37℃で16－20時間培養（前培養）しておいたプレートより単一コロニー （直径2－3mm）をとる。 ②50ml遠心チューブに入った15mlLB培地に300μℓ前培養した大腸菌を植え継ぎ、これを37℃で2時間位、OD₆₀₀が0.4～0.8になるまで振とう培養する。 ③培養液を50ml遠心チューブに移し、0℃になるまで氷上で10分間冷却する。 →ここまでは用意されていた。 ④4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑤卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。この際クリーンブース 内に持ち込む器具は70％エタノールで拭いた。50ml遠心チューブの蓋は火で炙った（滅菌処理）。 ⑥DNAの細胞膜表面への吸着を引き起こすため冷0.1M塩化カルシウムを1.5ml （750μℓ×2 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。氷上で15分間放置した。 ⑦4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑧卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。1分間乾燥した。 ⑨冷0.1M塩化カルシウムを0.6ml （600μℓ×1 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。 →コンピテントセル作製 ⑩ピペットチップを使い、塩化カルシウムでのコンピテントセルをエッペンチューブに50μℓずつ分注した。（ピペットチップ、エッペンチューブは滅菌してあるものを使った）ここに、プラスミドDNA溶液を静かに加えた。（下表参照）氷中でチューブをかき回す程度に混合した。そのまま氷上で30分間放置した。 コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl プラスミドDNAは何も入れない ｐUC19 50μl／ｍｌを5μl ｐUC（3HBDH）19 50μl／ｍｌを5μl 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる ⑪ヒートショックで細胞内にDNAを入れるため4
- レポート 理工学 DNA 形質転換 電気泳動
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DNA実験
- DNA実験 １、目的 制限酵素処理したDNAと未処理のDNAを用いて電気泳動を行い、その移動差を測定する。この移動差がプラスミドDNAのどのような違いに基づくものかを推定する。また、実験結果から制限酵素によりベクターがどのような作用を受けたかを調べる。 ２、材料と方法 Ⅰ制限酵素処理 まずマイクロピペットを用いて、プラスミドDNAを4μℓ、10x制限酵素用バッファーを2μℓ、H2Oを13μℓ、制限酵素１μℓをマイクロチューブに入れる。プラスミドDNAはa,bの２種類。制限酵素はEcoRⅠ、PstⅠの２種類を用意した。それぞれの組み合わせにより４種類のサンプルを作った。 １…a/Ec 2…a/Ps 3…b/Ec 4…b/Ps それぞれのサンプルは軽く撹拌して数秒程度遠心して37℃の恒温槽で1時間反応させた。反応させている間にアガロースゲルの作製を行った。 Ⅱアガロースゲル電気泳動 ア、アガロースゲルの作製 0.6ｇのアガロースの入った三角フラスコに泳動バッファー50ml加えて電子レンジで温めた。約60℃になったところでゲル作成台に流し込み約30分間放置した。ゲルが固まったところで、少量のH20を注いでコームを引き抜いた。 イ、泳動機のセッティング 泳動機に泳動バッファー400mlを加えてゲルを入れた。泳動機と電源をリード線でつないだ。 ウ、サンプルの添加 Ⅰの工程で反応させておいたサンプルを取り出し、10x泳動用サンプルバッファーを2μℓずつ加えて、撹拌、遠心を行った。また、未処理のプラスミドＤＮＡ a/bを3μℓとり、水を7μℓ加えて、10ｘ泳動用サンプルバッファー2μℓを加えた。（未処理のaをa´、未処理のbをｂ´とした） まず、分子量マーカー10μℓをゲルの穴の両端に添加した。その後、a´、a/Ec、a/Ps、b/Ec、b/Ps、b´の順に10μℓずつ添加した。 エ、電気泳動 全てのサンプルを添加したのち、泳動機の電圧を100Ｖに設定してスイッチを入れて約１時間泳動させた。 オ、ゲルの染色と観察 発泡スチロール容器にEtBr溶液を深さ１cmほど入れ、撹拌したのち、ゲルを台からはずして液につけた。約15分間染色した後、紫外線下で観察してポラロイド写真を撮影した。 ３、結果 Ⅰ分子量マーカーを泳動したレーンで観察されるＤＮＡの各バンドの移動差を測定し、片対数のグラフ用紙にプロットした。(図Ⅰ)7700bp以下の分子量ではほぼ一直線上になった。 Ⅱ制限処理したプラスミドDNAのレーンに見えるバンドの移動度を測定し、Ⅰで作製したグラフを利用して各バンドの分子量を推定した。（図Ⅱ） それぞれのサンプルのレーンで見られたバンドの位置と分子量(推定)を下に示した。 サンプル 泳動距離 分子量 a´ 2.10cm 2100bp a/Ec 1.75cm 3090bp a/Ps 1.75cm 3090bp 2.10cm 2100bp b/Ec 1.75cm 3090bp 2.42cm 1550bp b/Ps 1.47cm 4400bp b´ 1.70cm 3250bp ４、考察 Ⅰ、制限酵素処理のDNAと未処理のDNAの移動には明白な違いが現れた。プラスミドDNAのaにおいては。EcoRⅠで処理したものは泳動距離が短くなり、PstⅠ処理したものでは、泳動距離が短くなったものと、未処理のときと距離が変わらない２つのバンドが出現した。プラスミドDNAのbについては、EcoRⅠ処理し
- レポート 理工学 DNA 電気泳動 制限酵素
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フィルタの実験
- 考察 実験で用いたフィルタを受動フィルタと能動フィルタという点から考察してみる。 フィルタ?の実験で用いた定K型フィルタは抵抗、キャパシタ、インダクタなどの受動素子から構成されていたので、受動フィルタ呼ばれる。受動フィルタは、単に増幅素子（トランジスタ、オペアンプなど）を使用しないフィルタである。この点で、特定の伝達関数を（必要な素子数に関して）最も簡略に実現する。受動フィルタには他の利点もある。受動フィルタは能動素子を含んでいないので、電源が不要である。オペアンプによる帯域幅の制限を受けないので、非常に高い周波数でも正常に動作する。受動フィルタは、能動デバイスで処理できないような大きな電流や電圧レベルを伴う分野で使用できる。また、受動フィルタは、能動利得素子を使用した回路と比べてわずかな雑音しか発生しない。受動フィルタが発生する雑音は、単に抵抗素子からの熱雑音だけであり、注意深く設計すれば、この雑音の振幅も相当小さくできる。受動フィルタの欠点は、能動素子を使用しないので信号利得を与えることができないことである。非常に有用な受動フィルタを製造するには性能の良いインダクタが必要となるので高いコストがかかる。更に、複雑な受動フィルタは設計するのが難しく、時間がかかる。
- レポート 理工学 フィルタ 情報学 実験
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全体公開 2014/07/27
