唾液分泌(ラット耳下腺腺房細胞からのアミラーゼ分泌)

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    資料紹介

    2006/11/06-07
    実験題目:唾液分泌(ラット耳下腺腺房細胞からのアミラーゼ分泌)
    実験者:windowsxp
    共同実験者:Mac
    目的・緒言:
    唾液腺房細胞からのアミラーゼ分泌はムスカリン様受容体もしくはα1アドレナリン受容体、
    Substance P受容体が刺激を受けて細胞内カルシウム濃度が上昇することで、またはβアドレナ
    リン受容体が刺激を受けて細胞内 cAMP濃度が上昇することで活性化される。今回の実験では AC
    hでムスカリン様受容体を、Isoproterenol でβアドレナリン受容体をたたきそれぞれの系での
    アミラーゼ分泌を測定する。
    唾液腺は自律神経の二重支配を受けている。副交感神経は延髄の下唾液神経核から舌咽神経を
    経て耳神経節に至り、ここから耳下腺を支配する。また延髄の上唾液神経核から顔面神経、鼓索
    神経、舌神経を経てから、腺の近傍でニューロンを変えて顎下線おとび舌下腺を支配する。交感
    神経系は T1~T4から出て、上顎神経節でニューロンを変えて唾液腺を支配する。
    図 1 腺房細胞の唾液分泌の機序
    材料:ラットの耳下腺
    試薬:HEPES buffer、コラゲナーゼ typeⅡ、BSA、ACh および Isoproterenol、基質緩衝液 1 ml
    (0.4 mg のデンプンを含む)、発色試薬
    手順:
    1.安楽殺したラットから唾液腺(耳下腺)を採取した。
    2.HEPES bufferを入れたシャーレ内で耳下腺から脂肪組織およびリンパ節等をできるだけ取
    り除いた。
    3.耳下腺を小鋏で細断した(約 400 回)。
    4.細胞分離液(コラゲナーゼ typeⅡ・BSA1%を含む HEPES buffer)5ml 入りの小フラスコ
    にミンチ状にした耳下腺を入れ、100%酸素を 10 秒間通気した後、15 分ごとに軽くピペッテ
    イングしながら 37℃で 30 分間インキュベーションした。
    5.フィルターユニットを用いて細胞分離液を濾過した。
    6.400G× 10 秒で遠心した後、上清を捨てた。さらに 5ml の BSA入り HEPES bufferを加え
    てピペッテイングし、遠心した。この操作をもう一度繰り返した。
    7.2 回目の遠心上清を捨てた後、BSA入り HEPES bufferを 5ml 加えた。ピペッテイングし
    た後に細胞懸濁液を新しい三角フラスコに移し 37℃で 30 分間インキュベーションした。
    8.細胞懸濁液を遠心管に移し、400G× 10 秒で遠心した。
    9.ペレットを巻き上げないように注意しながら、上清を取り除いた。
    10.3ml の BSA 入り HEPES bufferを加え、ゆっくりとピペッテイングしながら 3 本の test
    tube(No.1-3)にそれぞれ 1ml ずつ分注した(下表)。
    11.No.2および 3 の tube にそれぞれ ACh および Isoproterenol の Stock solution を 3μ|加え
    た。これらを 37℃で 30 分間インキュベーションした。
    12.インキュベーション終了後、400G× 10 秒で遠心し、上清から 500μ|採取しサンプチュー
    ブに移し氷上で保存した(下表)。
    Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5
    Control + ACh + Isoproterenol
    蒸留水 HEPES+BSA
    ※ACh、Isoproterenol は加えた時点で

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    2006/11/06-07
    実験題目:唾液分泌(ラット耳下腺腺房細胞からのアミラーゼ分泌)
    実験者:windowsxp
    共同実験者:Mac
    目的・緒言:
    唾液腺房細胞からのアミラーゼ分泌はムスカリン様受容体もしくはα1アドレナリン受容体、
    Substance P受容体が刺激を受けて細胞内カルシウム濃度が上昇することで、またはβアドレナ
    リン受容体が刺激を受けて細胞内 cAMP濃度が上昇することで活性化される。今回の実験では AC
    hでムスカリン様受容体を、Isoproterenol でβアドレナリン受容体をたたきそれぞれの系での
    アミラーゼ分泌を測定する。
    唾液腺は自律神経の二重支配を受けている。副交感神経は延髄の下唾液神経核から舌咽神経を
    経て耳神経節に至り、ここから耳下腺を支配する。また延髄の上唾液神経核から顔面神経、鼓索
    神経、舌神経を経てから、腺の近傍でニューロンを変えて顎下線おとび舌下腺を支配する。交感
    神経系は T1~T4から出て、上顎神経節でニューロンを変えて唾液腺を支配する。
    図 1 腺房細胞の唾液分泌の機序
    材料:ラットの耳下腺
    試薬:HEPES b..

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