核酸に関する実習

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    ?)DNA-1 大腸菌プラスミドDNAの精製
    目的
     今回の実習は、核酸の基本的な取り扱い法と性質を理解することを目的とする。DNA-1では大腸菌プラスミドDNA(pUC19)を簡便法で精製することを試みる。
    手順
    1. プラスミドpUC18を有する大腸菌DH5α株のovernight culture 1.5mLを1.7mL tube2本にとり、12,000rpmで2分間遠心した。
    2.P-200のピペットマンで上清を完全に除いた後、菌体に200μLのCell Resuspention Solution?を加え、菌体をピペットマンで均一に懸濁した。
    3.250μLのCell Lysis Solution?を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして菌体を溶かした。
    4.250μLのNeutralization Solution?を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして液を中和した。
    5.4の混合液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を別の1.7mL tubeに取った。
    6.均一に撹拌した200μLのQuantum Matrix?を加え、良く撹拌した。
    7.氷上で2〜3分冷却した後、再懸濁した。
    8.12,000rpmで5分間遠心し、上清を捨てた。
    9.500μLのWash Buffer?を加え、ボルテックスミキサを用いて再懸濁した。
    10.12,000rpmで5分間遠心して、上清を捨てた。
    11.操作9、10を繰り返した。
    12.200μLの精製水を加え、均一に懸濁した。
    13.12の懸濁液を、Spin Filterをセットした別の1.7mL tubeのSpin Filterに注意深く取った。
    14.12,000rpmで30秒間遠心し、Spin Filterをtubeから外した。
    15.得られたプラスミド溶液を1本のtubeに合わせ、プラスミドのエタノール沈殿を行う。
    <エタノール沈殿>
    15のtubeに50μLの3mol/L NaOAc(pH5.2)を加えた。

    さらに1000μLの無水エタノールを加え、緩やかに撹拌した後、氷上で5分間冷却した。

    12,000rpmで10分間遠心し、ピペットマンで沈殿を足らないよう注意しながら上清を別のtubeに移した。

    沈殿に200μLの70%エタノールを加え、表面を軽く洗った(リンスした)。

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    核酸に関する実習
    実験日 12月14、15日(水、木)
    Ⅰ)DNA-1 大腸菌プラスミドDNAの精製
    目的
     今回の実習は、核酸の基本的な取り扱い法と性質を理解することを目的とする。DNA-1では大腸菌プラスミドDNA(pUC19)を簡便法で精製することを試みる。
    手順
    1. プラスミドpUC18を有する大腸菌DH5α株のovernight culture 1.5mLを1.7mL tube2本にとり、12,000rpmで2分間遠心した。
    2.P-200のピペットマンで上清を完全に除いた後、菌体に200μLのCell Resuspention Solution①を加え、菌体をピペットマンで均一に懸濁した。
    3.250μLのCell Lysis Solution②を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして菌体を溶かした。
    4.250μLのNeutralization Solution③を加え、tubeを数回緩やかに逆さにして液を中和した。
    5.4の混合液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を別の1.7mL tubeに取った。
    6.均一に撹拌した200μLのQuantum Matrix④を..

    コメント1件

    jhmqkhfm 購入
    今回必要だったものではなかった。
    2006/06/28 13:57 (10年5ヶ月前)

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