ヒューマニクス系実験

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    ウシ血清からのIgG抗体の精製の目的・手順
    目的
    Protein G sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、ウシ血清に含まれるIgG抗体を精製する。
    手順
    ?Protein G sepharose4 Fast FrowをPoly prepカラムに500μl加える。さらにTBSを10ml加え、室温で5分間静置【カラムの平衡化】
    ?ウシ血清1mlとTBS1mlを2mlチューブで混ぜる
    ?ウシ血清サンプルをカラムに加え、シーソーシェーカーで15分間振とうしながら反応させる
    ?壁を洗うようにカラムにTBSを10ml加え素通し、下部のふたをして、再びカラムにTBS10ml加える。
    ?上部、下部のふたを外してバッファーをビーカーに捨てる。上部、下部のふたを蒸留水でよく洗浄
    ?下部のふたをして、再びカラムにTBS10mlを加えて、??を再び行う。この洗浄を全部で3回繰り返す。
    ?カラムにTBS30mlを素通しする。キムワイプを下部につけ、毛細現象を利用しながら余分なバッファーを吸い取る。
    ?【溶出】0.1M Glycine Buffer(pH2.2)50μlを加え、指で軽く混ぜた後、室温で5分間静置。
    ?【Protein G sepharoseの除去】ピペットマンでゲルを吸い上げないように溶出液全量を吸い上げる。0.22umに全量を移して、チビタンRde30秒間遠心する。
    ??の溶出液に1MTrisHCl(pH8.8)を3.8μl入れ中和
    試薬類
    □Tris-buffered saline,TBS(20mM Tris-HCl(pH7.5),137mM NaCl)溶液 200ml
    □Protein G sepharose 4 Fast Flow(20倍希釈)1.2ml□ウシ血清2.2ml
    □0.1M Glycine Buffer(pH2.2)120μl□1M Tris HCl(pH8.8)15μl
    考察
    ?血清、血漿の違いとは、血清は血液が凝固して血球成分と淡黄色の透明な液体成分に分かれたときの液体成分のこと。血清には血液凝固にかかわる凝固因子が失われている。
     逆に血漿には血液凝固に必要な凝固因子が含まれている。
    ?Fc領域とは、抗原との結合活性を持たないばかりか、放置しておくと簡単に結晶化する性質をを持っている領域。免疫系の他の細胞表面に存在するFc受容体と反応し、細胞を活性化、あるいは機能を抑制したり、Fc部分それ自身に捕体成分を活性化するはたらきがあり、抗体の生物活性を発揮する部位のことである。

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    ウシ血清からのIgG抗体の精製の目的・手順
    目的
    Protein G sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、ウシ血清に含まれるIgG抗体を精製する。
    手順
    ①Protein G sepharose4 Fast FrowをPoly prepカラムに500μl加える。さらにTBSを10ml加え、室温で5分間静置【カラムの平衡化】
    ②ウシ血清1mlとTBS1mlを2mlチューブで混ぜる
    ③ウシ血清サンプルをカラムに加え、シーソーシェーカーで15分間振とうしながら反応させる
    ④壁を洗うようにカラムにTBSを10ml加え素通し、下部のふたをして、再びカラムにTBS10ml加える。
    ⑤上部、下部のふたを外してバッファーをビーカーに捨てる。上部、下部のふたを蒸留水でよく洗浄
    ⑥下部のふたをして、再びカラムにTBS10mlを加えて、④⑤を再び行う。この洗浄を全部で3回繰り返す。
    ⑦カラムにTBS30mlを素通しする。キムワイプを下部につけ、毛細現象を利用しながら余分なバッファーを吸い取る。
    ⑧【溶出】0.1M Glycine Buffer(pH2.2)50μlを加え、指で軽く混..

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