生化学・応用遺伝子学実習レポート

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    [4]プラスミド(pGEX)による大腸菌の形質転換
    《実験目的》
    GSTをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドDNA(pGEX)をヒートショック法により大腸菌に導入し、発現させる。
    《原理》
    大腸菌の細胞壁に一時的に穴を開け、大腸菌を42℃で処理することによりそこからプラスミドを取り込ませる。この大腸菌を培養して増やすことにより、取り込ませたプラスミドを増幅させる。
    《実験器具・試薬》
    ブロックヒーター
    恒温インキュベーター
    振とう培養器
    ガスバーナー
    乾熱滅菌済み爪楊枝
    ピンセット
    発消毒用エタノール
    pGEXプラスミド入りチューブ
    JM109コンピテントセル溶液入りチューブ
    植付け用ループ
    LBプレート
    LB/ampプレート
    LB培養入りチューブ
    《実験の考察》
    《実験の課題》
    形質転換効率
    アンピシリンの役割
    アンピシリンの作用機構
    アンピシリン耐性の機構
    [5] プラスミド(pGEX)の精製
    《実験目的》
    プラスミド(pGEX)で形質転換した大腸菌を増殖させアルカリ法を用いてプラスミドを精製する。
    《原理》
    大腸菌に形質転換したプラスミドを精製するには、大腸菌ゲノムDNAや種々のRNA、鎖タンパク質や脂質を取り除くことが必要である。アルカリミニプレップ法で、Soln.?で浸透圧ショックを与えSoln.?に含まれるアルカリとSDSで溶菌と同時にタンパク質や脂質を変性させ沈殿させる。ゲノムDNAはアルカリ処理により1本鎖にした後Soln.?で中和することにより、菌体成分とともに凝集して除去される。そしてイソプロパノール沈殿により核酸を沈殿させ、RNAを取り除くためにRNase処理を行う。
    《実験器具・試薬》
    ステンレスチューブラック
    卓上高速遠心機
    ボルテックスミキサー
    シェイカー
    ブロックヒーター
    プラスチックスポイト
    Soln.?
    Soln.?
    Soln.?

    資料の原本内容( この資料を購入すると、テキストデータがみえます。 )

    生化学/応用遺伝子学実習
             実習期間; 2006年 5月16日~18日
                        22日~25日
            
    [4]プラスミド(pGEX)による大腸菌の形質転換
    《実験目的》
    GSTをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドDNA(pGEX)をヒートショック法により大腸菌に導入し、発現させる。
    《原理》
    大腸菌の細胞壁に一時的に穴を開け、大腸菌を42℃で処理することによりそこからプラスミドを取り込ませる。この大腸菌を培養して増やすことにより、取り込ませたプラスミドを増幅させる。
    《実験器具・試薬》
    ブロックヒーター 大腸菌を一定温度条件下で培養するために用いた 恒温インキュベーター 大腸菌を一定温度条件下で培養するために用いた 振とう培養器 一定温度条件下で振とう培養させる際に用いる ガスバーナー バーナーにかざしエタノールを飛ばすために使う 乾熱滅菌済み爪楊枝 発生したコロニーを採取する際に用いる ピンセット 発生したコロニーを爪楊枝で採取しその際に直接爪楊枝に触れないようにピンセットを用いる 消毒用エタノール 無菌的に操作を行うため..

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