連関資料 :: PCR
資料:7件
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PCRとは何か
- 生物工学 レポート２ 題名 PCR(polymerase chain reaction)法の原理 PCR法は1983年にマリス(K. Mullis)らによって考案されたものであり、短時間に大量の遺伝子を指数関数的に増幅させる方法の一つである。以下に、どのようなメカニズムによって増幅するかのを実験操作ならびにその予想結果を用いて説明した。 [実験操作及びその結果] まず始めに、試験管に目的のDNAのそれぞれの鎖に対して相補的なプライマーを増幅させたい部分につけて塩基対を形成させる。実際には、500～600塩基のプライマ―をつけるため塩基配列はもっと多いのだが、ここでは、１４塩基DNAを示した。 図1 増幅させる前の2本鎖DNA 増幅させたい2本鎖DNAを95℃まで熱変性させると以下のような状態になる。 図2 熱変性させて1本鎖になったDNA プライマーを大量に加えて温度を37℃まで下げ、それぞれの鎖にアニーリングさせると以下の状態になる。 図3 プライマーをつけ終わったDNA鎖 デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質としてDNAを72℃で反応させるとそれぞれのプライマーから鋳型鎖
- レポート 理工学 PCR 遺伝子増幅 遺伝子 マリス
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分子生物学実験(PCR法)
- 分子生物学実験 ＜目的＞ 遺伝子の増幅と解析の原理と方法を理解するとともに、具体的な手法を身につける。 ＜原理＞ カラーセレクションの原理 クローニングベクターであるpBluescriptは制限酵素EcoRIによってMCS部が切断される。同様に目的のDNAもEcoRIによって切断されるので、これらを連結させることができる。なお、クローニングベクターには、制限酵素を用いたクローニングの操作がやりやすいように、制限酵素部位または制限部位が、１カ所に集まるように設計されており、マルチクローニングサイト（MCS）と呼ばれている。ＭＣＳには、使用頻度の高い制限酵素部位が集められていて、しかもほとんど制限部位がベクター内で唯一の部位になるように設計されている。つまり、ＭＣＳ領域内のある制限酵素部位を、対応する制限酵素で切った場合、そこ１カ所のみが切断されるので、ベクターの必要要素を失うことなく、クローニングができる。 そして、目的のDNA断片を連結させたpBluescriptをコンピテントセル化したJM１０９株に導入して形質転換を起こす。 しかし、連結反応の段階において、セルフライゲーションが起こり、目的のDNA断片がMCSに挿入されずに元に戻るという可能性が生じる。 この場合、カラーセレクションを行うことで、目的のDNA断片がMCSに挿入されたかどうかを区別することができる。 ベクター：pBluescript 宿主細胞：コンピテントセル化したＪＭ１０９株
- PCR 電気泳動 アガロース カラーセレクション 制限酵素 ハイブリダイザーション サザントランスファー pBluescript
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RT-PCRによる遺伝子発現解析実験
- RT-PCRによる遺伝子発現解析実験 実験日 7月12日 目的 暗所に順応させたタバコと、短時間の光照射を行ったタバコを用い、光によって転写レベルで発現誘導を受ける葉緑体遺伝子(psbD)のmRNAの変動を測定する 原理 RT-PCR : 遺伝子発現を調べる実験で、目的遺伝子の発現量が少ないとき、調整できるRNA量に限界があるときは、PT-PCRが威力を発揮する。RT-PCRはRNAを逆転者反応によりcDNAにし、これに対してPCRを行うものである。 psbD遺伝子 : 光合成の光化学系IIの反応中心タンパク質D2をコードする葉緑体遺伝子。青色光・近紫外光で特異的な発現誘導を受ける。psbD上流の光応答プロモーター(psbD LRP)が光による活性化を受ける。 実験材料 実験1 3日間暗処理を行ったタバコ(D),暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L) TRIzol(酸性フェノール,タンパク質変性剤) 500μl クロロフォルム 100μl イソプロパノール 250μl 75%エタノール 500μl DW 実験2 RT反応液 9μl MgCL2 5ml 10XRT buffer x1 dNTP 1mM Rnase Inhibitor 1U/μl AMV 逆転写酵素 0.25 U/μl Random 9 primer 2.5μM RNA sample 0.2μg RNA(0.2μg/μl) 1μl PCR反応液 40μl 5X PCR buffer x1 Ex Taq 1.25U/μl PsbD 上流primer 0.2μM PsbD下流 primer 0.2μM 実験3 6x loading buffer 2μl 1％アガロースゲル 実験4 ・RNA loading buffer 6μl 実験方法 実験1 RNAの抽出 3日間暗処理を行ったタバコ(D)、および暗処理後4時間の光照射処理を行ったタバコ(L)をもちいた。 約100mgのタバコ葉をエッペンチューブに入れた。 直ちに500μlのTRIzolを加え、ペッセルで完全にすりつぶした。 室温で5分間静置した。 100μlのクロロフォルムを加え、15秒間手で振ってよく攪拌した。室温に2－3分間静置した。 12000xg、4℃で10分間遠心分離した。 300μlの上澄み液を別のクリーンなエッペンチューブに移した。 250μlのイソプロパノールを加え、混合した。 10分間室温で静置した。 12000xg、4℃で10分間遠心分離した。 上澄み液をピペットマンで完全に吸い取った。この時、沈殿を吸わないように注意した。 RNAの沈殿に500μlの75％エタノールを加え、エッペンチューブを軽く傾けて内壁を洗った。激しく攪拌してはいけない。 12000xg、4℃で5分間遠心分離し、上澄みを吸い取った。 5分間風乾した。 50μlのDWに溶解した。使用するまで、氷上に静置した。 サンプルを2μl取り、98μlの水で100倍希釈し、紫外線吸収を測定した(230,260,280nm)。 実験2 RT-PCR反応 各自のRNAサンプルを0.2μg /μlに希釈した。 PCRチューブにRT反応液9μlを入れた。 0.2μg /μlのRNAを1μl加えた。 反応液をピペットマンを使い静かに混合した。 スピンダウンをした。 PCR装置にセットした。 次の条件で逆転写反応を行った。 30℃ 10min 55℃ 25min 99℃ 5min 5℃ 5min 逆転写反応が終わったら、PCRチューブを氷上に置き、スピンダウン
- レポート 理工学 RT-PCR 遺伝子発現 タバコ 葉緑体遺伝子 mRNA
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PCR法、制限酵素等を用いた大腸菌内DNAの解析
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